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Desafio da classificação taxonómica intra-específica do PCV2

Todas as vacinas disponíveis no mercado europeu e norte americano estão baseadas no genótipo PCV2a, ainda que os mais prevalentes sejam os PCV2b e PCV2d. Muito embora se tenha demonstrado um nível significativo de protecção cruzada entre estes três genótipos, seria interessante avaliar se a eficiência das vacinas é equivalente frente a todos estes genótipos.

O PCV2 emergiu como uma das infecções víricas mais devastadoras em produção suína, causando um impacto económico relevante pelas perdas directas e os gastos nas estratégias de controlo. O PCV2 é o agente etiológico do síndrome da ausência de crescimento multisistémico pós-desmame (PMWS), hoje em dia conhecido como doença sistémica por PCV2 (ES-PCV2, figura 1). Os estudos epidemiológicos e experimentais evidenciaram que a diversidade genética pode afectar, potencialmente, a virulência de PVC2, caracterizada por surtos globais de genótipos emergentes e a circulação de estirpes recombinantes. Talvez esta seja a razão pela qual a classificação intra-específica de PCV2 tem sido historicamente controversa. Em 2008, o consórcio europeu de doenças associadas ao circovirus suíno propôs uma nomenclatura standartizada para as definições genotípicas de PCV2 baseadas em comparação de sequências emparelhadas (www.pcvd.eu). A análise de sequências de nucleótidos do genoma de PCV2 completo e da cápside (ORF2) definiram 2 limites de distância de 0,020 e 0,035, respectivamente. Quando a distância (p) entre 2 sequências era maior que tais valores, assumia-se que as estirpes pertenciam a 2 genótipos diferentes. Os resultados de tais análises reconheceram quatro genótipos chamados PCV2a, PCV2b, PCV2c e PCV2d (também conhecido como PCV2b mutante).

Cerdos de tres meses de vida con ES-PCV2. Nótese la columna vertebral marcada, indicativa de retraso en el crecimiento y la palidez

Figura 1. Porco de 3 meses de vida com ES-PCV2. Note-se a coluna vertebral marcada, indicativa de atraso no crescimento e a palidez (anemia).

Desde 2008, um grande número de sequências de PCV2 foram depositadas no GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) e foram propostos vários novos genótipos, ainda que nem sempre tenham sido validadas. Uma proporção significativa de ditas sequências tem uma origem recombinante e em alguns casos estiveram a recircular com uma prevalência crescente em vários países asiáticos e Estados Unidos. Num artigo recente (Franzo et al, 2015), uma equipa internacional de investigadores voltou a analisar a taxonomia intra-específica de PCV2 e a definição genotípica para comprovar a sua validez actual, unificar a nomenclatura e evitar posteriores erros de interpretação.

Os resultados obtidos indicam que, com as sequências actualmente disponíveis de cápside e genoma de PCV2, têm sido violados vários dos pressupostos da metodologia que foi estabelecida há quase uma década para estabelecer os limites. Concretamente, não foi cumprido o pressuposto da taxa de substituição de nucleótidos entre os diferentes genótipos de PCV2. Além disso, a definição de um único valor de corte para definir os genótipos de PCV2 parece complicada. Ainda mais importante, os limites propostos para a definição de genótipo podem carecer indubitavelmente de sentido (figura 2). Estas evidências, junto à enorme quantidade de novas sequências disponíveis, têm implicações importantes na classificação intra-específica de PCV2. Portanto, os limites aplicados desde 2008 para definir os genótipos de PCV2 não são aplicáveis a todas as estirpes de PCV2, pelo que o método deve ser reconsiderado.

Análisis de umbral del genoma completo de PCV2 y de secuencias de ORF2

Figura 2. Resultados da comparação de sequências do genoma completo de PCV2 (a) e de sequências de ORF2 (b). É representada a proporção de sequências compreendidas num intervalo de distância p de 0,01. Também são indicados os limites propostos para o genoma completo (0,020), a cápside (0,035), assim como os limites resultantes da nova análise (0,038, 0,068 e 0,090).

Como consequência é proposto um método alternativo para determinar o genótipo das estirpes de PCV2 de forma inequívoca. O método sugerido tem em conta a presença de várias estirpes recombinantes que, de facto, pertencem a mais que um genótipo. Considerando a alta taxa de recombinação descrita, houve preferência para uma classificação baseada no gene ORF2. Com o objectivo de oferecer um método de classificação inequívoca, foram seleccionadas várias sequências de referência cuja classificação era clara segundo os métodos filogenéticos. Isto permitiu definir quatro genótipos utilizando tanto a reconstrução filogenética como quarenta e sete posições de nucleótidos marcadores específicos para cada genótipo. Estas posições de marcadores caracterizavam cada genótipo de um modo consistente (>95%) e podiam ser utilizadas como referência para atribuir uma sequência problema a determinado genótipo. O método de classificação proposto, além de ser robusto, é muito rápido e fácil de executar.

A classificação taxonómica de PCV2 continua a ser um desafio. Os resultados obtidos confirmam e validam a variabilidade das sequências virais e a elevada frequência de recombinação intra e inter-genótipo entre as estirpes de PCV2 ressaltando a dificuldade para estabelecer uma definição de genótipo inequívoca para este vírus. Além disso, a possibilidade do aparecimento de novos genótipos de PCV2 no futuro é muito elevada e pode ser muito mais necessário ter novos, e robustos, métodos de genotipagem.

A classificação de PCV2 em genótipos é relevante do ponto de vista prático. Além disso, todas as vacinas disponíveis no mercado europeu e norte americano estão baseadas no genótipo PCV2a, ainda que os mais prevalentes sejam os PCV2b e PCV2d. Muito embora se tenha demonstrado um nível significativo de protecção cruzada entre estes três genótipos, seria interessante avaliar se a eficiência das vacinas é equivalente frente a todos estes genótipos. Por outro lado, até ao momento, uns estudos filogenéticos publicados indicam que podem ser produzidas certas alterações em aminoácidos em sequências de PCV2 procedentes de explorações vacinadas e não vacinadas. De facto, foi especulada a possibilidade de que de futuro se possam gerar vírus mutantes devido à pressão de vacinação. Portanto é chave uma monitorização genotípica adequada para avaliar a eficiência das vacinas.

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