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Técnicas laboratoriais para avaliar a resposta imunitária e de anticorpos no porco

Este artigo explica como funcionam e em que é que se baseiam os testes ELISA, de seroneutralização (SN), de hemaglutinação (HI) e IPMA.

ELISA (ensaio por imunoabsorção ligado a enzimas)

A técnica ELISA é muito utilizada para a detecção quantitativa de anticorpos contra agentes patogénicos em fluidos biológicos e tem alta especificidade e sensibilidade. É realizado em placas de microtitulação de 96 poços e baseia-se na interacção antigénio-anticorpo e numa reacção dependente de enzima (colorimétrica, fluorescente ou quimioluminescente). Os valores da densidade óptica (DO) medidos por um espectrofotómetro podem ser directa ou indirectamente proporcionais à concentração / quantidade de anticorpos detectados.

Para detectar anticorpos totais anti-virais ou anti-bacterianos / micoplasmáticos, é utilizado um ELISA indireto em que um antigénio do agente patogénico é fixado à fase sólida (os poços) e a amostra é incubada para formar um complexo antigénio-anticorpo. Subsequentemente, um anticorpo secundário conjugado é adicionado para gerar o sinal de leitura. Este sistema permite avaliar muitas amostras com um único anticorpo secundário conjugado.


Figura 1: ELISA indirecto para a detecção de anticorpos anti-clamidia no soro.

Figura 1: ELISA indirecto para a detecção de anticorpos anti-clamidia no soro.

Os ELISAs competitivos e inibitórios quantificam os anticorpos na amostra de acordo com a sua capacidade de interferir com um ensaio pré-titulado. Em ambos os testes, a amostra é adicionada a um sistema pré-titulado e a actividade de ligação é determinada a partir do grau de interferência.

Por exemplo, para detectar a resposta humoral à PRRS, a proteína N do vírus é utilizada para capturar todos os anticorpos específicos contra o PRRSv em placas de 96 cavidades revestidas com antigénio. Um anticorpo secundário conjugado com peroxidase é então adicionado para visualizar os anticorpos anti-PRRSV capturados.

A resposta imunitária humoral varia entre os diferentes animais e os níveis de anticorpos detectados não reflectem necessariamente a virulência da estirpe de PRRSV. Além disso, os anticorpos maternos podem interferir, gerando falsos positivos. Geralmente, os anticorpos ELISA permitem a detecção de anticorpos totais, que são o conjunto de células plasmáticas circulantes e de células B de memória específicas para agentes patogénicos específicos, portanto, para detectar adequadamente a resposta da memória humoral, é essencial detectar anticorpos neutralizantes, vírus dirigidos contra epitopos imunodominantes. A detecção de anticorpos totais por ELISA pode fornecer informações úteis sobre a seroconversão e o efeito potenciador de vacinas e / ou infecções subsequentes.

Seroneutralização do vírus (SN)

O teste SN permite detectar e quantificar os anticorpos neutralizantes específicos para um vírus numa amostra de soro. Normalmente incubam-ser previamente séries de diluições a um 1/2 da amostra sérica com uma quantidade conhecida de vírus e depois junta-se às células diana sensíveis à infecção viral. Isto permite que os vírus não neutralizados infectem as células e se possa determinar qual é a maior diluição que é capaz de neutralizar a infecção vírica e a presença de um efeito citopático.

Os ensaios SN são muito sensíveis e específicos, eles medem o título de anticorpos neutralizantes após a infecção ou vacinação. A quantificação do título pode basear-se na presença ou ausência do efeito citopático ou na evidência de infecção viral por uma técnica imunorreactiva. O teste SN é útil para avaliar o nível de reactividade cruzada sorológica entre antissoros de vacinas e isolados virais para avaliar e correlacionar a proteção cruzada.

Figura 2a: Seroneutralização (SN) para a detecção de anticorpos contra o herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1) no soro.

Figura 2a: Seroneutralização (SN) para a detecção de anticorpos contra o herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1) no soro.

Figura 2b: Seroneutralização (SN) para a detecção de anticorpos contra o vírus da diarreia viral bovina (BVDv) no soro.

Figura 2b: Seroneutralização (SN) para a detecção de anticorpos contra o vírus da diarreia viral bovina (BVDv) no soro.

Teste de hemaglutinação (HI)

É um teste sorológico para a detecção de anticorpos e baseia-se no princípio de que a hemaglutinina dos vírus da gripe, tal como outros vírus, tem um efeito hemaglutinante nos glóbulos vermelhos, sendo por isso o método padrão para a detecção de anticorpos anti-gripe. Isso significa que o sangue coagulará quando esses vírus forem adicionados, porque os glóbulos vermelhos se ligarão à hemaglutinina na superfície do vírus.

Os anticorpos específicos induzidos como resposta imunitária humoral à infecção ou vacinação com o vírus podem inibir a aglutinação por ligação às hemaglutininas.

Se a amostra contiver anticorpos específicos para hemaglutinina, uma reacção antigénio / anticorpo ocorre quando o vírus da influenza é adicionado. Isso ficará evidente com a seguinte adição de eritrócitos: eles não mais se aglutinam porque a reacção será inibida.

O título de soro pode ser usado para determinar as diluições para as quais a hemaglutinação ainda é inibida. O valor recíproco da maior diluição em que a hemaglutinação ainda é inibida fornece o título de anticorpo.

Figura 3: Test da hemoaglutinação para a detecção de anticorpos anti-Brucela no soro.

Figura 3: Test da hemoaglutinação para a detecção de anticorpos anti-Brucela no soro.

Teste da imunoperoxidase em monocamada (IPMA)

O teste IPMA é amplamente utilizado para a detecção de anticorpos contra vírus, especialmente aqueles que não têm efeito citopático, como o PCV2. Os anticorpos neutralizantes (NA) são os principais responsáveis pela protecção e desaparecimento da infecção. Uma vez que existe uma correlação positiva entre os títulos de anticorpos IPMA e os títulos de VNA, os títulos de IPMA podem ser considerados uma medida indireta de NA. O IPMA não é o teste de escolha para diagnósticos de rotina, pois depende de culturas de células infectadas com vírus e a análise de muitas amostras de soro é relativamente lenta. Por essas razões, o teste IPMA é frequentemente substituído por testes mais automatizados, que têm uma leitura objectiva final, como ELISA.

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