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Técnicas laboratoriais para avaliar a resposta celular imunitária nos suínos

Actualmente várias técnicas laboratoriais permitem avaliar a resposta imunitária celular.

Actualmente, várias técnicas laboratoriais avançadas são usadas para avaliar a resposta imunitária celular nos suínos, quer seja pela utilização de células imunitárias do sangue (células mononucleares do sangue periférico, PBMC) quer seja através das células imunitárias derivadas de órgãos periféricos como o timo, os gânglios linfáticos, o baço, o intestino, o pulmão e a medula óssea. Estas técnicas foram bastante aperfeiçoadas em veterinária e actualmente podem ser usadas em investigações experimentais ou de campo. A citometria de fluxo também é usada em oncologia de pequenos animais.

Uma das técnicas mais utilizadas é o ensaio ELISPOT de IFN-y através do qual se pode quantificar o número de células secretoras de IFN-y com elevada sensibilidade após estimulação celular com um antigénio viral (por exemplo, PRRSV, PCV2, ADV) ou antigénios micoplasmais/bacterianos (ex. Mycoplasma hyopneumoniae, Escherichia coli).

São isoladas as PBMC do sangue completo de animais que entraram em contacto com o agente patogénico devido à vacinação prévia e/ou infecção natural e são quantificados os linfócitos T que são reactivados com um antígeno do mesmo agente patogénico ou pelo próprio agente patogénico

Este ensaio pode fornecer informações relevantes sobre o estado efectivo de activação do sistema imunitário do animal. De facto, a indução específica através de vírus ou bacteriana de células T de memória e efectoras é detectada pela secreção de IFN-y ao nível da célula única, visualizando em placas de 96 loci.

Utilizando o ensaio ELISPOT, pode monitorizar-se a reactividade imunológica ao longo do tempo comparando formas de vacinação clássicas ou inovadoras (por exemplo, administração intramuscular vs. vacinação intradérmica sem agulha), também se podem comparar programas vacinais ou realizar infecções com agentes patogénicos emergentes para avaliar a resposta dos animais infectados e a eficácia de novas vacinas em termos de protecção e protecção cruzada.

A resposta imunitária celular é avaliada mediante a contagem de pontos produzidos devido a secreção de IFN-γ por cada célula individual e geralmente é expressa em número de células secretoras de IFN-γ por milhão de células testadas. Se a amostra for positiva, significa que o animal foi exposto ao antigene viral ou bacteriano no campo e que, portanto, desenvolveu imunidade com células T de memória que pode dar um grau de protecção a uma exposição subsequente ao mesmo agente patogénico e/ou protecção cruzada contra variantes do agente patogénico.

Fig. 1. Respostas específicas de antigene IFN-γ ELISPOT em PBMC a agentes patogénicos de suínos. ADV: vírus da doença de Aujeszky; PRRSV: vírus do Síndroma Reprodutivo e Respiratório Suína; PCV2: Circovirus Suíno tipo 2; M.hyo .: Mycoplasma hyopneumoniae. Cada mancha é devido à secreção de IFN-γ por linfócitos T reactivos de memória/efetores. Entre parênteses é indicado o agente patogénico usado para reactivar as células nas placas de teste.
Fig. 1. Respostas específicas de antigene IFN-γ ELISPOT em PBMC a agentes patogénicos de suínos. ADV: vírus da doença de Aujeszky; PRRSV: vírus do Síndroma Reprodutivo e Respiratório Suína; PCV2: Circovirus Suíno tipo 2; M.hyo .: Mycoplasma hyopneumoniae. Cada mancha é devido à secreção de IFN-γ por linfócitos T reactivos de memória/efetores. Entre parênteses é indicado o agente patogénico usado para reactivar as células nas placas de teste.

Citometria de fluxo é uma técnica sensível e específica que permite identificar (imunofenotipagem) e quantificar sub-populações de células imunitárias no sangue periférico (PBMC) ou células isoladas de tecidos/órgãos imunitários que são coradas utilizando anticorpos conjugados com fluorocromo que reagem com os principais marcadores imunitários intracelulares ou de superfície.

Por conseguinte, podem observar-se alterações nesses sub-grupos durante tratamentos experimentais específicos ou em tratamentos de campo, tais como vacinas ou administração de imunoestimulantes ou outros fármacos, bem como em infecções experimentais e naturais. Normalmente, os marcadores mais utilizados para citometria de fluxo são as moléculas de CD (cluster de diferenciação) expressas na superfície das células imunitárias, através das quais vários sub-conjuntos de monócitos (por exemplo CD172, CD14, CD16, CD163) e linfócitos (CD3, CD4, CD8, CD27, CD1, CD2, CD16, CD14, CD25, CD79) podem ser identificados.

O estado de activação destas células pode ser determinado através de tinção intracelular de moléculas relacionadas com a activação e secreção de moleculas como as citoquinas pró-inflamatórias (por exemplo, IL-1, TNF-α, IL-6) e as imunocitoquinas (por exemplo, IL-2, IFN-γ, IL-10) e os factores de expressão (por exemplo, FoxP3).

Deste modo, após uma infecção e usando diversos tipos de tinção, podem identificar-se e estudar-se sub-grupos imunológicos polifuncionais capazes de produzir múltiplas citoquinas simultaneamente múltiplas. Estas parecem ser as células relevantes capazes de regular e fornecer depuração e protecção contra agentes patogénicos.

Fig. 2. Exemplos de fenótipos de células imunitárias de citometria de fluxo de células imunitárias quantificadas como percentagem ou valores absolutos [número de células / ml de sangue]) em PBMC de porco: ac) Sub-populações de linfócitos T: CD3 + CD4 + CD8- = linfócitos T auxiliares (Th) CD3 + CD4 + CD8 + = células T de memória CD3 + CD4-CD8 + = linfócitos T citotóxicos (CTL) de) sub-populações de monócitos pró-inflamatórios: CD172 + CD14 + CD16 + CD172 + CD16 + CD163 + CD172 + CD14 + CD163 + fg) CD4 + CD25 + FoxP3 + = linfócitos T regulatórios (Tregs) ..
Fig. 2. Exemplos de fenótipos de células imunitárias de citometria de fluxo de células imunitárias quantificadas como percentagem ou valores absolutos [número de células / ml de sangue]) em PBMC de porco: ac) Sub-populações de linfócitos T: CD3 + CD4 + CD8- = linfócitos T auxiliares (Th) CD3 + CD4 + CD8 + = células T de memória CD3 + CD4-CD8 + = linfócitos T citotóxicos (CTL) de) sub-populações de monócitos pró-inflamatórios: CD172 + CD14 + CD16 + CD172 + CD16 + CD163 + CD172 + CD14 + CD163 + fg) CD4 + CD25 + FoxP3 + = linfócitos T regulatórios (Tregs) ..

Linfoproliferação mediante estimulação in vitro com activadores policlonais mitogénicos (inespecíficos) e monoclonais (por exemplo, específicos para vírus e bactérias) pode ser uma maneira fácil de avaliar a reactividade das células T imunitárias quando o animal é submetido a tratamentos que podem alterar a resposta a mitógenos ou antígenos patogénicos que activem a proliferação e induzam uma mudança de células quiescentes para células proliferantes activadas (ou seja, linfoblastos).

A linfoproliferação pode ser avaliada através de um ensaio de MTT (incorporação e mudança de cor de um reagente por células em proliferação) mas também por citometria de fluxo através da quantificação dos linfoblastos (células de tamanho grande) e/ou incorporação de reagentes fluorescentes de proliferação após estimulação in vitro durante 2-5 dias.

Tecnologia Tetrâmetros tem sido usada em suínos para quantificação por citometria de fluxo de linfócitos T citolíticos/citotóxicos de memória antigene-específicos e, mais recentemente, para quantificação de células B de memória antigene-específicas.

Baseia-se no uso de macromoléculas fluorescentes carregadas com um antigene que são expostas a uma população de células imunitárias mistas para interagir com as células B e T que reconhecem selectivamente o antigene e, presumivelmente, são responsáveis pela eficácia da resposta e depuração celular/redução da quantidade de agentes patogénicos no corpo do animal. Este é um método altamente específico e sensível que é capaz de detectar pequenas fracções de células B e T de memória. Por exemplo, foi desenvolvido para reconhecimento de linfócitos T citotóxicos CD8+ específicos para vírus da Gripe Suína (SIV) específicos para vírus da Febre Aftosa (FMDV) e linfócitos B de memória específicos para PRRSV.

O ensaio de citotoxicidade utilizam linfócitos T efectores citolíticos/citotóxicos (E) isolados previamente e depois incubados durante 3-4 dias em placas de 96 loci com células-alvo (T) em diferentes proporções (E/T); a eficácia da citólise fornece informações sobre o potencial imunitário das células T efectoras contra células-alvo in vivo potencialmente infectadas.

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