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Serotipado de isolados de campo de Actinobacillus pleuropneumoniae por PCR

Uma nova análise baseada em PCR pode ajudar a determinar todos os serotipos conhecidos de App, o que se pode usar para escolher a vacina mais adequada.

Determinar o serotipo de Actinobacillus pleuropneumoniae (App) é importante para o seu controlo, já que os diferentes serotipos têm diferente potencial de virulência (dependendo da zona geográfica), e esta informação pode-se utilizar para escolher a vacina mais apropriada (Gottschalk, 2015). Com base na sua cápsula, há 18 serotipos conhecidos de App (Bossé et al., 2018a), sendo 1, 5, 9 e 11 os mais virulentos. Com base nas necessidades de NAD (nicotinamida adenina dinucleótida), diferenciam-se os isolados do biotipo 1 dos do biotipo 2, ou NAD-independentes.

Classicamente, para determinar o serotipo têm-se utilizado análises serológicas que incluem a aglutinação, a co-aglutinação, a imunodifusão, a hemaglutinação indirecta e a precipitação no anel. Contudo, são necessários anti-soros específicos com títulos altos e as reacções cruzadas entre serotipos (p.ex. 3/6/8 e 1/9/11) são um problema. Encontramos que a maioria dos isolados do Reino Unido e da Irlanda definidos serologicamente como serotipo 3 pertenciam ao serotipo 8 (O'Neill et al., 2010). Devido a estes problemas, desenvolvemos análises moleculares usando a reacção em cadeia da polimerase (PCR) para ampliar sequências de ADN específicas de cada serotipo que se encontram nos genes de biossintese da cápsula (Bossé et al., 2014). O uso destas sequências específicas de cada serotipo permitiu desenvolver um teste específico para o serotipo 16 (Bossé et al., 2017) e conduziu à recente descoberta dos serotipos 17 e 18 (Bossé et al., 2018a). Com a descoberta dos serotipos 16-18 decidimos produzir um teste de PCR que pudesse definir todos os serotipos de App conhecidos. Contudo, os serotipos 9 e 11 não se podem diferenciar por PCR, já que os seus loci capsulares são praticamente idênticos (Bossé et al., 2018b) e tampouco podem determinar-se através de testes serológicos (Gottschalk, 2015). O teste de PCR tinha que confirmar o isolado como App e determinar o serotipo específico. Para confirmar App, utilizámos primers que ampliavam uma região de 418 bp do gene apxIV, específico de App (Schaller et al., 1999). Contudo, devido ao grande número de serotipos (n=18), tivemos que formular duas cadeias de multiplex PCR (mPCR), capazes, cada uma das quais, de detectar muitos serotipos. O mPCR1 detecta os serotipos 1-12 e 15 (figura 1A) e o mPCR2 os serotipos 13-14 e 16-18 (figura 1B). Os isolados que ampliam apenas uma banda apxIV no mPCR1 são analisados depois com o mPCR2.

Figura 1. Detecção específica de serotipos de amplicons das estirpes de referência de App por (A) mPCR1 para os serotipos 1-12 e 15 e (B) mPCR2 para os serotipos 13–14 e 16–18. Serotipo das estirpes de referência 1-18 = linhas 1-18. Ambos mPCR mostram um amplicon apxIV de 418 pb que confirma que as amostras são App (adaptado de Bossé et al., 2018b).
Figura 1. Detecção específica de serotipos de amplicons das estirpes de referência de App por (A) mPCR1 para os serotipos 1-12 e 15 e (B) mPCR2 para os serotipos 13–14 e 16–18. Serotipo das estirpes de referência 1-18 = linhas 1-18. Ambos mPCR mostram um amplicon apxIV de 418 pb que confirma que as amostras são App (adaptado de Bossé et al., 2018b).

O mPCR2 também confirma o biotipo mediante primers desenhados para ampliar um fragmento de 1339 bp do gene nadV (que confere a independência ao NAD). O conjunto de nucleótidos nadV de 1339 bp só se detecta nas estirpes de referência do biotipo 2 (serotipos 13-14). Devemos assinalar que outros serotipos (p.e. 2, 4, 7 y 17) foram descritos como pertencentes ao biotipo 2 e alguns serotipos de isolados norte-americanos do serotipo 13 como pertencentes ao biotipo 1 (Gottschalk, 2015).

O modelo de ADN para as PCRs pode ser ADN purificado (quer seja de bactérias cultivadas ou de amostras de tecidos) obtido usando kits comerciais, lisados de células bacterianas inteiras fervidas ou colónias de uma cultura em placa. O ADN purificado fornece melhores resultados, enquanto que as PCRs de colónias podem dar resultados parciais/falsos negativos se as colónias são muito pegajosas e difíceis de lisar, como mostram os três isolados clínicos do serotipo 2 que só ampliaram a banda específica do serotipo de PCR de colónia, mas que ampliaram tanto esta como a banda específica de apxIV ao usar ADN purificado (figura 2). Em raras ocasiões, os isolados não conseguirão ampliar apxIV, inclusive utilizando ADN purificado (Bossé et al., 2014). Quando isto acontece, podem utilizar-se primers alternativos de apxIV (oAPXIV-TSP1/2) para confirmar App (Tegetmeyer et al., 2008). mPCR1 e mPCR2 podem-se usar para identificar novos serotipos, como fizemos com os 17 e 18 (Bossé et al., 2018a). Os isolados de App que produzem uma banda de apxIV mas não conjuntos de nucleótidos específicos de serotipo podem, potencialmente, ser um serotipo novo, ainda que a ausência de uma banda específica de serotipo possa ser devida a uma falta de concordância do primer em isolados divergentes ou dever-se à presença de um elemento de inserção que altera o locus da cápsula. A sequenciação do genoma completo do isolado confirmará qual destas opções é a correcta.

Figura 2. Comparação da ampliação de bandas a partir de PCR de colónias purificadas (linhas 1-3) versus ADN (linhas 4-6) para três isolados clínicos de serotipo 2 utilizando o mPCR1.
Figura 2. Comparação da ampliação de bandas a partir de PCR de colónias purificadas (linhas 1-3) versus ADN (linhas 4-6) para três isolados clínicos de serotipo 2 utilizando o mPCR1.

Em resumo, a monitorização de serotipos de APP numa exploração ou país é importante para controlar a doença. Os nossos PCRs de serotipado (mPCR1 e mPCR2) são ferramentas úteis para identificar serotipos virulentos, as vacinas correctas a utilizar (comerciais ou autógenas) e para evitar que porcos com estirpes de App potencialmente virulentas sejam introduzidos em explorações não expostas. Além disso, o nosso método tem o potencial de identificar novos serotipos de App e melhorar os diagnósticos.

Agradecimentos

A investigação sobre APP no laboratório dos autores trem o apoio do Conselho de Investigação de Biotecnologia e Ciências Biológicas do Reino Unido.

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