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Utilidade da PCR em Tempo Real no diagnóstico das colibaciloses suínas

Permite analisar os factores de virulência directamente sobre a amostra clínica, evitando etapas intermédias de cultivo e determinações sobre cada um dos isolados seleccionados, o que implica a uma poupança notável de tempo e de custos.

A Escherichia coli faz parte da flora intestinal do porco e sob determinadas circunstâncias produz quadros de colibacilose, uma doença que se pode manifestar sob diferentes processos tais como a diarreia neonatal, diarreia pós-desmamte, doença dos edemas, septicémia, etc…

Um adequado diagnóstico compreende uma exaustiva anamnese, uma correcta seleção das amostras e um completo diagnóstico diferencial apoiado por diversas técnicas. A mera detecção de estirpes patogénicas não justifica que haja sempre doença dado que é habitual encontrar portadores assintomáticos. A identificação de estirpes relevantes pela sua virulência e a sua diferenciação do resto da flora habitual do intestino é um desafio diagnóstico de plena actualidade e a PCR em tempo real (qPCR) aplicada à detecção dos factores de virulência (FV) de E. coli apresenta-se como uma potente ferramenta capaz de gerar valiosa informação.

Partindo da extracção dos ácidos nucleicos de diferentes matrizes biológicas (cultivo, fezes, intestino ou zaragatoas rectais), os ensaios qPCR reconhecem regiões específicas do genoma de E. coli que codificam distintos FV. Neste trabalho, cada ensaio foi desenhado para a detecção de um FV distinto (ver tabela 1). Uma qPCR adicional (ECCO) foi utilizada para confirmar a presença de E. coli nas amostras e assegurar que todas as etapas da técnica se realizaram correctamente. A qPCR tem carácter qualitativo mas também quantitativo (imagem 1), vantagem notável em relação à sua predecessora, a PCR convencional.

Cuanto menor es el valor Cq, mayor es la concentración inicial del parámetro estudiado en la muestra

Imagem 1. O produto de amplificação apresenta-se em tempo real à medida que passam os ciclos térmicos (ciclos) de tal maneira que o nível de fluorescência registada (ΔRn) aumenta exponencialmente. O Cq é o número de ciclos em que a fluorescência começa a ser detectada. Quanto menor é o valor Cq, maior é a concentração inicial do parêmetro estudado na amostra.

A avaliação de estirpes virulentas nos processos de colibacilose realizou-se tradicionalmente mediante um cultivo microbiológico inicial, isolamento de colónias de E. coli e a posterior caracterização das suas FV. Esta metodologia apresenta o inconveniente de uma análise limitada ao número de isolamentos seleccionados confiando a exactidão do diagnóstico à representatividade destes dentro do total da população de E. coli na amostra estudada. Desta forma, corre-se o risco de passarem despercebidas populações não maioritarias de E. coli que, contudo, têm relevância clínica.

A qPCR permite analisar os factores de virulência directamente sobre a amostra clínica, evitando etapas intermédias de cultivo e determinações sobre cada um dos isolados seleccionados, o que implica a uma poupança notável de tempo e de custos. Dado o carácter quantitativo da técnica pode-se estabelecer uma relação entre o número de cópias detectado para um determinado gene de virulência e a população total de E. coli presente na amostra. Deste modo poderiamos interpretar a possibilidade de conseguir isolar uma estirpe com uma combinação particular de FV.

Esta metodologia apresenta certas limitações devido ao indeterminado número de cópias dos distintos genes que codificam cada FV dentro de diferentes populações bacterianas. Não obstante, cumpre o objectivo proposto: avaliar a possibilidade de encontrar, na amostra, uma população de E. coli com uma determinada combinação de FV.

De seguida iremos expor um exemplo prático. Ante um caso de suspeita clínica da Doença dos Edemas em animais de engorsa, enviram-se para o laboratório quatro intestinos delgados (ID) pertenecentes, todos eles, a animais afectados para avaliar a presença de E. coli verotoxigénico. O pool formado pelos 4 intestinos foi analisado directamente mediante qPCR, resultando uns valores Cq para F18, Stx2e e ECCO quase coincidentes (Tabela 1). Estes resultados podem-se interpretar como a presença de uma população amplamente maioritária de E. coli que possui os genes codificantes para F18 e Stx2e, ou seja, uma estirpe verotoxigénica. Ainda se obteve um valor debilmente positivo para F4 (Cq=36,9) o que indicaria a presença, muito minoritária, de populações com o referido FV.

Simultaneamente realizou-se um cultivo microbiológico às amostras em que 12 colónias de E. coli foram seleccionadas. A sua comparação fenotípica revelou a presença de uma única estirpe (imagen 2). A caracterização da mesma mediante determinação das suas FV por qPCR confirmou que se tratava de uma potencial estirpe verotoxigénica já que foram detectados simultaneamente os genes codificantes para F18 e Stx2e.

Tabela 1. Resultados qPCR.

FV Pool 4 intestinos delgados Estirpe E. coli isolada
F4 POS (Cq = 36,9) neg
F5 neg neg
F6 neg neg
F18 POS (Cq = 22,28) POS (Cq = 16,58)
F41 neg neg
LT neg neg
STa neg neg
STb neg neg
Stx2e POS (Cq = 22,39) POS (Cq = 17,29)
eae neg neg
ECCO POS (Cq = 21,1) POS (Cq = 16,97)

Grado de similitud entre los aislamientos de E. coli

Imagem 2. Dendograma. Apresenta-se o grau de similitude entre os isolamentos de E. coli em função do padrão de fermentação de açúcares. Todos os isolamentos têm uma similitude superior ao ponto de corte estabelecido nos 0,98 (linha de pontos); o que nos faz concluir que se trata de uma única estirpe.

Em conclusão, a qPCR aplicada directamente a amostras clínicas pode pressupor uma poupança substancial de recursos e tempo oferecendo uma informação capaz de nos levar a uma interpretação que fornença soluções ao delicado diagnóstico das colibaciloses suínas.

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