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A reacção em cadeia da polimerase (PCR) é uma das ferramentas de diagnóstico mais comuns actualmente utilizadas pelos veterinários de produção de suínos. É utilizado não só para fins de diagnóstico, mas também para melhorar a biossegurança através da vigilância e controlo de doenças. Como tal, é essencial compreender as vantagens e desvantagens de tal tecnologia ao interpretar os resultados. É também importante lembrar que mesmo que a mesma tecnologia seja utilizada para diferentes agentes patogénicos, deverá haver diferenças na interpretação destes resultados.
Informação do teste
A PCR é concebida para a detecção de material genético (DNA ou RNA) a partir de bactérias ou vírus. O processo começa com a extracção do DNA ou do RNA da amostra, que posteriormente é sujeita a ciclos térmicos de amplificação. Se o material extraído for RNA, o primeiro passo é converter o RNA em DNA (tecnicamente conhecido como DNA complementar ou cDNA). Os ciclos térmicos consistem num processo de 3 etapas: 1) desnaturação, 2) alinhamento e 3) extensão, resultando na duplicação do DNA presente na amostra. Portanto, em cada ciclo (1 Ct), assumindo 100% de eficiência, será obtido o dobro da quantidade de DNA presente. O objectivo é continuar o processo de amplificação até ser detectado DNA suficiente para que a amostra seja positiva ou até 30-40 ciclos, dependendo da concepção do teste específico utilizado.
Esquema do mecanismo da PCR.
O processo de extracção é uma etapa crítica do teste PCR, uma vez que afecta a quantidade e qualidade do material genético na amostra testada. É essencial utilizar o processo de extracção adequado para o tipo de amostra a ser testada (soro, fluidos orais, tecidos, etc.). A etapa 2 do processo de amplificação (alinhamento) requer a utilização de primers ou iniciadores, que são pequenos pedaços de sequências de ADN especificamente concebidos para ligar e ajudar a replicar a sequência genética específica do agente patogénico em questão. Para agentes patogénicos em constante evolução genética (como o vírus PRRS), estes primers devem ser actualizados periodicamente para garantir que novas estirpes continuem a ser detectadas.
O número limite de ciclos de teste (normalmente cerca de 30-40) é estabelecido determinando que, se o processo de amplificação continuasse, o teste acabaria por ser positivo devido ao alinhamento e extensão espontâneos. Isto sugere que resultados positivos fracos, com valores de Ct elevados perto do limiar, necessitam de uma consideração especial ao interpretar os resultados, especialmente no final de um surto.
Existem dois usos diferentes dos testes PCR na medicina veterinária suína. A tradicional PCR em gel e a mais moderna PCR em tempo real. Ambos os testes funcionam da mesma forma, com base na amplificação do DNA ou RNA. A diferença é que a PCR em gel é 'lida' apenas uma vez no final do teste, enquanto que na PCR em tempo real os resultados do teste são 'lidos' após cada ciclo. A vantagem da PCR em tempo real é que permite a obtenção de resultados quantitativos/semiquantitativos.
Agrupamento (pooling) de amostras para análise
Os testes PCR têm uma elevada capacidade para detectar pequenas quantidades de material genético em amostras (sensibilidade analítica) devido ao processo de amplificação, que oferece a possibilidade de analisar várias amostras com um único teste (pooling). É importante lembrar que o agrupamento irá, por definição, diluir a amostra analisada. Isto não deve ser um problema quando a concentração esperada de um determinado agente patogénico é elevada (especialmente no início de um surto de doença). Contudo, a agregação pode ser um problema quando a concentração do patogéneo numa amostra positiva é baixa, como no final de um surto de doença ou num tipo de amostra que já se espera que seja diluída (fluidos orais).
